天然胶乳医用手套水抽提蛋白质的测定 GB/T 21870标准

天然胶乳医用手套水抽提蛋白质的测定采用改进Lowry法（GB/T 21870-2008/ISO 12243:2003），是评估手套中可溶性蛋白质含量的关键方法，直接关系到产品的过敏风险控制。以下是该方法的详细解析：

方法背景与意义

1. 天然胶乳过敏问题
   天然胶乳（如Hevea brasiliensis）含多种蛋白质（如Hev b 1-13），可能引发Ⅰ型超敏反应（如接触性荨麻疹、哮喘）。水抽提蛋白质是手套使用过程中易释放的过敏原组分，其含量需严格限定。

2. 改进Lowry法的优势

• 灵敏度高：可检测低至0.1 μg的蛋白质，适用于微量过敏原分析。

• 抗干扰性强：通过优化试剂配方，减少胶乳中非蛋白质成分（如橡胶烃、脂类）的干扰。

• 标准化程度高：GB/T 21870-2008等效采用ISO 12243:2003，确保国际互认。

方法原理

改进Lowry法结合了双缩脲反应与Folin-Ciocalteu试剂显色：

1. 蛋白质变性：在碱性条件下，蛋白质中的肽键与Cu²⁺形成紫色络合物（双缩脲反应）。

2. 还原反应：Folin-Ciocalteu试剂中的磷钼酸-磷钨酸被蛋白质中的酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸还原，生成蓝色化合物（钼蓝/钨蓝）。

3. 吸光度测定：在750 nm波长下测定显色液的吸光度，通过标准曲线计算蛋白质浓度。

关键步骤与操作要点

1. 样品制备

• 水抽提：

• 称取手套样品（如5 cm×5 cm片段），置于蒸馏水或生理盐水中（液固比10:1）。

• 振荡提取（如37℃、150 rpm、2小时），离心（如3000 rpm、10分钟）取上清液。

• 稀释：根据预实验结果，将提取液稀释至蛋白质浓度在标准曲线范围内（通常0.1-100 μg/mL）。

2. 试剂配制

• Lowry试剂A：

• 2% Na₂CO₃（w/v） + 0.4% NaOH（w/v） + 0.16% Na₂K₄(Fe(CN)₆)·3H₂O（w/v） + 0.4%酒石酸钾钠（w/v）。

• Lowry试剂B：

• 1% CuSO₄·5H₂O（w/v）与试剂A按1:50体积比混合，现用现配。

• Folin-Ciocalteu试剂：

• 稀释至原浓度的1/2（如1:1或1:2），避免强酸性条件破坏蛋白质结构。

3. 标准曲线绘制

• 标准品：牛血清白蛋白（BSA），配制浓度梯度（如0、10、20、40、60、80、100 μg/mL）。

• 显色反应：

• 取标准品或样品1 mL，加入5 mL Lowry试剂B，混匀后室温静置10分钟。

• 加入0.5 mL Folin-Ciocalteu试剂，迅速混匀，室温避光反应30分钟。

• 吸光度测定：以空白管调零，在750 nm波长下测定吸光度，绘制标准曲线。

4. 样品测定

• 取1 mL稀释后的提取液，按标准曲线步骤进行显色反应，计算蛋白质浓度（μg/mL）。

• 结果计算：

蛋白质含量（μg/g）=mC×V×D

• C：标准曲线查得的蛋白质浓度（μg/mL）；

• V：提取液体积（mL）；

• D：稀释倍数；

• m：样品质量（g）。