化妆品3T3成纤维细胞中性红摄取光毒试验 OECD432

化妆品光毒性反应

化妆品光毒性指化妆品在太阳光或紫外线下，吸收紫外光的能量，在皮肤中释放能量以致对皮肤造成损伤作用，对剂量有依赖性，当化合物在体内累积到一定剂量的时候，就会发生毒性反应。

化妆品发生皮肤光毒性反应需要有3个条件，化妆品必须能够到达活细胞，以保证其能够和活细胞进行有效接触，就是发生光毒反应所需的光(紫外线或可见光)波长适当，能够有效穿透皮肤，还有就是光敏物质能够吸收反应发生所需的能量。

化妆品光毒性试验体外替代方法

第一次欧洲替代法研究中心关于体外光毒性测试的专题研讨会中，首次成功确立了体外光毒性测试的研究阶段，允许体外3T3中性红成纤维细胞摄取光毒试验在欧盟范围内用于常规测试。这种体外细胞光毒性测试方法不能涉及到光毒性检测的所有领域，欧洲化妆品，盥洗用品和香料协会和ESAC提出应该额外建立一些其它的覆盖整个光毒性领域的体外光毒性体外试验。随着1999年第二次专题会议的召开和近年来相关科研工作者的研究，各种试验方法相继被发现。

到目前为止，传统的光毒性试验体外替代方法主要包括3T3中性红成纤维细胞摄取光毒试验、人重三维组皮肤模型、人体角肮细胞试验和肝细胞试验、光-红细胞联合试验、酵母试验和组氨酸光氧化试验等。

光毒性体外替代方法较多，但应用于化妆品方面的试验方法还很有限。目前应用于化妆品方面的方法主要分为细胞模型和人工皮肤模型两大类。

细胞模型光毒性体外替代试验

1、3T3成纤维细胞中性红摄取光毒试验(3T3neutral reduptake phototoxicity assay，3T3 NRU PTassay)

3T3成纤维细胞中性红摄取光毒性试验(3T3NRUPT)是一个已经通过验证的替代试验方法(ECB.41，OECD432)，目前化妆品方面的光毒性体外检测多数还是利用此种方法，其原理是中性红染料被活细胞的溶酶体摄取(其摄取量与活细胞量直接相关)，通过测定BALB/c3T3成纤维细胞经化学物质和紫外线照射的联合作用后的细胞存活率，判断该化学物质是否具有光毒性。该方法能够预测人体试验结果的体外试验。

2、光-红细胞联合试验

光红细胞联合试验包括光溶血(photohaemolysistest)和血红蛋白光氧化试验(haemoglobin photooxidationtest)两个试验，其原理为光毒物质进入红细胞内后接触光线，促使细胞膜阳离子流出，脂质过氧化，蛋白交联，形成甲基化血红蛋白，细胞肿胀、破裂至溶血，形成“光动力学反应”。

目前，3T3中性红成纤维细胞摄取光毒试验作为唯一通过验证的光毒性体外替代方法，应用面较广相对于光-红细胞联合试验，其准确度更高(光-红细胞联合试验阴性率低，假阴性较多)。

人工皮肤模型光毒性体外替代试验

1、EPISKIN

EpiSkin模型是由今天全球Zui大的化妆品公司之--oulaiya生产，该公司对皮肤和人工皮肤模型一直在进行积极地研究，其皮肤研究中心坐落在法国欧奈苏布瓦。

EpiSkin模型是由E.Tinois在1997年首次研制出来，就是在I型牛胶原基质上覆盖上IV型人胶原，上面再放置培养13天、分化形成角质层的人角质细胞作为表皮。

在考察该模型是否适用光毒性检测的研究中，将一些弱光毒性物质(6-甲基香豆素和氧氟沙星)的实验效果与一种强光毒性物质(氯丙嗪)的效果进行了对比。SLS和磺异苯酮作为阴性对照品。让模型接触受事物1小时后，暴露在无致毒剂量的UVA照射之下。经过18小时后，进行MTT分析测试，确定释放到培养基中的IL-1a量。经过UVA照射的光毒性化合物会使细胞死亡率上升，并且会使IL-1a释放量增加，说明该模型具有辨别光毒性物质的能力。

2、SkinEthic

该公司位于法国尼斯，是MartinRosdy在1992建立的，目的是为了开发和推销人工皮肤模型除SkinEthic。除了开发人工皮肤，还开发等角膜、咽、牙龈、生殖道等人工上皮。

SkinEthic模型的总体皮肤结构与人类表皮有着很高的相似度，具有与人类皮肤一样的角质层、颗粒层、棘细胞层。

SkinEthic模型的实验数据通过与体内尚可研究的试验数据作比较，得出该模型用于光毒性评价具有很好的相关性。

3、 EpiDerm

Epiderm是由美国阿什兰MatTek公司生产的皮肤模型，在1993年投放市场，该公司还提供其他类型的模型，如含黑素细胞的重组皮肤、重组角膜上皮。Epiderm模型是在1994年由Cannonetal.首次发现的。该模型是用来源于常人皮肤的表皮角质细胞培养形成多层的高度分化的人表皮模型。其形态上与正常人表皮相似，包含基底层、棘层、颗粒层和一层内含细胞间质层的角质层。

Licbsch etal.将原来ZEBET(德国动物试验替代方法制定和论证中心)提供的用SKIN2模型测试光毒性的实验方案转用到Epiderm模型上。实验方法为将受试物以5种不同的浓度与与该模型接触，分别在无致毒剂量的UVA、可见光和无致毒剂量的UVA、无光照两种情况下评价其反应。在照射一天后，使用MTT分析法确定细胞毒性，表明该模型能够正确而鉴别光毒性化合物。