工业循环冷却水中铁细菌检测 GB/T 14643.6方法

方法核心原理：绝迹稀释法 (MPN法)

该方法的核心是 “Zui大可能数” (Most Probable Number, MPN) 法，也称为绝迹稀释法。其基本原理是：

1. 系列稀释：将水样进行一系列成倍数的稀释（如10倍、100倍、1000倍等）。

2. 多管培养：每个稀释度接种多个重复试管（标准中规定为3管或5管）到特定的液体培养基中。

3. 选择性培养：使用专属的液体培养基。该培养基为铁细菌提供生长所需的营养（如铁源），抑制其他非目标菌的生长。

4. 生长指示：铁细菌生长后，会产生特定的现象（如培养基出现棕红色絮状沉淀、液面有褐色皮膜等）来判断是否为阳性。

5. 统计计算：根据各个稀释度出现阳性反应的试管数量，查阅专用的MPN统计表，计算出原始水样中铁细菌的Zui大可能浓度，单位通常是 个/mL (个每毫升)。

检测详细步骤 (概要)

1. 采样

• 容器：使用清洁、无菌的带塞玻璃瓶或聚乙烯瓶。

• 采样量：至少500mL。

• 要求：采样应具有代表性，避免污染。采样后立即检测，若不能及时检测，需在4℃冰箱保存并尽快检测（通常不超过24小时）。

2. 试剂与培养基制备

• 培养基：使用标准中指定的铁细菌试验培养基。其主要成分通常包括：

• 镁源：如硫酸镁

• 钙源：如氯化钙

• 铵盐：如硫酸铵（氮源）

• 磷酸盐：如磷酸氢二钾（磷源）

• 有机物：如乙酸钠（碳源和能源）

• 关键成分——铁源：硫酸亚铁铵。这是铁细菌生长的关键指示物，被氧化后生成氢氧化铁沉淀。

• 配制：按标准规定配方称取各组分，溶解，调节pH至6.6~6.8，分装于试管中（每管约10mL），121℃高压蒸汽灭菌15分钟。

3. 接种与培养

• 稀释：以无菌操作，用无菌稀释水（如生理盐水）对水样进行10倍系列稀释，通常制备10⁻¹, 10⁻², 10⁻³ 等多个稀释度。

• 接种：

• 选择3~5个适宜的稀释度。

• 每个稀释度接种3支（或5支）培养基试管。

• 每支试管接种1.0 mL 相应稀释度的水样。

• 设置一组空白对照（只接种类似的无菌稀释水）。

• 培养：将接种后的试管置于28±1℃ 的恒温培养箱中，培养14天。

4. 结果观察与判断

• 阳性判断：培养结束后，观察试管内的现象。铁细菌生长的阳性特征是：

• 培养基液面产生棕红色或褐色的皮膜（菌苔）。

• 培养基内出现棕红色絮状沉淀。

• 培养基清亮度发生变化，变得浑浊。

• 阴性判断：培养基保持原来的蓝绿色（源于硫酸亚铁铵），清澈透明，无沉淀和皮膜。

• 记录：记录每个稀释度下呈现阳性反应的试管数量。

5. 结果计算与报告

• 查MPN表：根据每个稀释度（如10⁻¹, 10⁻², 10⁻³）对应的阳性试管数，查阅GB/T 14643.6标准附录中提供的MPN检索表（3管或5管法表）。

• 计算：从表中查出的MPN值再乘以中间稀释度的倍数，即为原始水样中铁细菌的浓度（个/mL）。

• 示例：若你接种了10⁻¹, 10⁻², 10⁻³三个稀释度，每个稀释度3管。其阳性管数分别为（3, 2, 0）。查3管MPN表，对应的MPN值为15。那么这个15代表的是中间稀释度（10⁻²）的MPN值。原始水样的铁细菌浓度为：15 × 10 = 150个/mL。（因为10⁻²的稀释倍数是100倍，查表值是每100mL中的可能数，换算到每mL需要乘以10？这里需要根据标准附录表的说明进行准确计算，通常表头会注明单位。常见的正确计算是：MPN值 × Zui高稀释度的倒数。例如，若阳性结果出现在10⁻²和10⁻³，则以10⁻²为Zui高稀释度，结果为MPN值 × 100个/mL。务必以标准附录表的说明为准）。

• 报告：报告形式为：“铁细菌含量：X.X × 10ⁿ 个/mL”。

方法特点与注意事项

• 优点：

• 灵敏度高，适用于菌量较低的水样。

• 是检测具有特定生理功能（如氧化铁）的菌群的经典方法。

• 缺点：

• 耗时较长（需要14天培养）。

• 结果是统计估计值，而非计数。

• 无法区分铁细菌的具体种类。

• 注意事项：

1. 无菌操作：整个过程中必须严格进行无菌操作，防止外来污染。

2. 培养基质量：培养基的配制和灭菌必须准确，pH值要调准，否则影响细菌生长和结果判断。

3. 稀释度选择：应根据水样的预期污染程度选择合适的稀释度范围，以保证有稀释度的所有试管均为阳性，也有稀释度的所有试管均为阴性，这样结果才准确。

4. 仔细观察：阳性结果的判断要准确，棕红色沉淀和皮膜是典型特征。

GB/T 14643.6 提供的绝迹稀释法（MPN法）是监测工业循环冷却水中铁细菌污染程度的一种可靠、标准的定量方法。通过系列稀释、选择性培养和统计估算，可以有效评估系统中铁细菌的数量，为判断系统腐蚀和沉积风险、评估杀菌剂效果提供重要的数据支持。