酒店用水嗜肺军团菌检测 GB/T 18204.5-2013方法

根据GB/T 18204.5-2013标准，酒店用水嗜肺军团菌的检测方法主要采用平板培养法，结合特定培养基和生化实验进行鉴定，以下是具体步骤和要点：

一、采样要求

采样点设置

淋浴水/浴池水：采样点位于淋浴喷头出水口、浴池进水口/回水口、热水储水箱（若存在），重点采集水温25~45℃的滞留水（军团菌繁殖适宜温度）。

冷却水塔：采样点设置在距塔壁20cm、液面下10cm处；冷凝水采样点设置在排水管或冷凝水盘处。

采样体积：至少采集1L水样，使用无菌容器收集，避免污染。采样前不消毒，不冲洗管道（需检测生物膜中的菌）。

记录参数：水温、pH值、余氯含量（余氯≥0.5mg/L可抑制军团菌生长）。

样品保存与运输

样品需在4℃冷藏条件下24小时内送检；若延迟送检，需冷冻至-70℃保存，避免光照和剧烈震荡。

二、检测方法（平板培养法）

前处理

酸处理：取5ml水样，用盐酸-氯化钾缓冲液调节pH至2.2，轻轻摇匀后放置5分钟，杀灭杂菌。

热处理：取1ml水样，置于50℃水浴中加热30分钟，激活军团菌。

过滤浓缩：将水样通过0.22μm或0.45μm滤膜过滤，滤膜置于15ml灭菌水中充分洗脱。

接种与培养

培养基：使用甘氨酸-万古霉素-多粘菌素B-环己亚胺（GVPC）琼脂平板，该培养基可抑制杂菌生长，促进军团菌繁殖。

接种量：取洗脱样品、热处理样品及酸处理样品各0.1ml，分别接种GVPC平板。

培养条件：将平板置于35~37℃、2.5% CO₂浓度的培养箱中培养7~10天。观察到培养物生成后，反转平板继续孵育10天，注意保湿。

菌落观察与鉴定

菌落特征：军团菌菌落颜色多样，呈白色、灰色、蓝色或紫色，表面光滑，呈典型毛玻璃状，部分菌落在紫外灯下有荧光。

初步验证：从平皿上挑取2个可疑菌落，分别接种于缓冲木炭酵母浸膏（BCYE）琼脂平板和缺乏L-半胱氨酸的BCYE-CYE琼脂平板。若菌落在BCYE平板上生长，而在BCYE-CYE平板上不生长，则为军团菌。

生化实验：进一步进行氧化酶试验（-至弱+）、硝酸盐还原试验（-）、脲酶试验（-）、明胶液化试验（+）、水解马尿酸等生化实验，确认菌种。

血清学分型：使用嗜肺军团菌诊断血清进行分型，确定具体血清型。

三、检测限与结果判定

检出限：

传统平板培养法的检出限为1 CFU/L（需浓缩水样）。

若水样中军团菌浓度较低，可通过膜过滤浓缩提高检出率。

结果报告：

若检测结果为阳性（即检出嗜肺军团菌），需报告具体菌落数量及血清型。

根据相关标准（如GB 37488-2019），酒店用水嗜肺军团菌不得检出/100mL；WHO建议高风险场所（如医院）应<1 CFU/L，普通建筑<100 CFU/L。

四、方法优缺点与改进方向

优点：

平板培养法是检测嗜肺军团菌的“金标准”，特异度高（可达）。

可直接分离出活菌，为后续生化实验和血清学分型提供基础。

缺点：

敏感度较低（60%~80%），易受杂菌干扰。

培养周期长（7~10天），无法检测不可培养状态（VBNC）的军团菌。

改进方向：

分子生物学方法：如PCR或实时荧光定量PCR（qPCR），可快速扩增军团菌特异性基因片段，4~6小时出结果，灵敏度高，但无法区分死菌/活菌。

免疫学方法：如侧流免疫层析法（ICA），适用于现场快速筛查，15分钟出结果，但仅适用于尿液样本（临床诊断）。

酶底物法：如Legiolert试剂，通过颜色变化判断军团菌存在，操作简单，7天内出结果，适用于饮用水检测。