循环冷却水异养菌菌数测定 平皿计数法 HG/T 4207-2011

一、 核心概念解读

循环冷却水系统：

工业中用于冷却工艺介质的水系统。水在换热器与冷却塔之间循环使用。

系统特点：适宜的温度、丰富的氧气、光照（冷却塔区域）、以及由空气和水源带来的营养物质，使其成为微生物（细菌、藻类、真菌）生长的“温床”。

异养菌 (Heterotrophic Bacteria)：

指需要从有机化合物中获取碳源和能量的细菌。它们是循环冷却水中数量Zui多、种类Zui繁杂的菌群。

为何要监测：异养菌总数是评价循环冷却水微生物污染程度和杀菌剂效果的Zui重要指标。过高的菌数会导致：

微生物粘泥 (Slime)：细菌及其分泌物形成粘性物质，附着在管道和换热器表面，降低换热效率，增加能耗。

under deposit corrosion(垢下腐蚀)：粘泥覆盖下的金属表面易形成缺氧区，导致局部腐蚀。

堵塞管道：大量粘泥的堆积会堵塞过滤器、喷嘴和管道。

平皿计数法 (Plate Count Method)：

一种经典的活菌计数方法。其原理是：一个活的微生物细胞，在适宜的固体培养基上，经过培养能形成一个肉眼可见的菌落（Colony Forming Unit, CFU）。通过计数菌落数来推算原始样品中的微生物浓度。

二、 测定方法详解 (依据 HG/T 4207-2011)

1. 方法概要

将一定量、经过适当稀释的循环冷却水样与熔融的培养基混合，倾注入平皿中。待培养基凝固后，在规定的温度下培养一定时间，计数平皿上长出的菌落数，计算出每毫升水样中的异养菌总数。

2. 主要试剂与设备

培养基：通常使用 营养琼脂 (Nutrient Agar) 或 R2A 琼脂。R2A琼脂更适合培养水中受损的或贫营养的细菌，计数结果通常更高、更准确。

稀释液：无菌生理盐水（0.85% NaCl溶液）或磷酸盐缓冲液，用于稀释水样。

仪器设备：

无菌平皿（培养皿）

无菌移液管或无菌移液器及吸头

恒温培养箱：能控制在 (28±1)°C 或 (35±1)°C（标准中规定）

压力蒸汽灭菌器（用于培养基和器具的灭菌）

无菌三角瓶、试管等

水样：用无菌的、带塞三角瓶或采样瓶采集循环冷却水样品。采样后在4小时内检测，否则需冷藏并不得超过24小时。

3. 操作步骤

第一步：水样的稀释

由于循环冷却水中的菌数可能很高，直接涂布可能无法计数（菌落长成一片），需要进行系列稀释。

准备数个装有9mL无菌稀释液的试管，编号为10⁻¹, 10⁻², 10⁻³...（即稀释10倍、100倍、1000倍...）。

用无菌吸管吸取1mL充分混匀的水样，加入第一支试管（10⁻¹）中，充分混匀。

从第一支试管中吸取1mL液体，加入第二支试管（10⁻²）中，充分混匀。

依此类推，制备一系列稀释度的水样。选择哪个稀释度进行培养取决于水样的污染程度，通常需做2-3个稀释度。

第二步：倾注平皿 (Pour Plate Method)

取适量无菌平皿（每个稀释度做2-3个平行），标记好稀释度、样品名、日期。

用无菌吸管分别吸取1.0mL各稀释度的水样注入对应的无菌平皿中。

尽快将预先熔化并冷却至45-50°C（手感烫但不烫手）的营养琼脂培养基约15mL倾注入平皿中。

立即在桌面上轻轻顺时针、逆时针转动平皿，使水样与培养基充分混合均匀。

水平放置，待培养基完全凝固。

第三步：培养

将凝固后的平皿倒置（防止冷凝水滴落砸碎菌落或导致蔓延）于恒温培养箱中，在 (28±1)°C 或 (35±1)°C 下培养 3d（天） 或按标准规定的时间。

第四步：菌落计数

培养结束后，取出平皿。

选择菌落数在30~300 CFU之间的平皿进行计数。该范围内的计数被认为统计学上Zui准确。

如果所有平皿的菌落数都小于30，则记录Zui低稀释度的菌落数（并注明“估计数”）。

如果所有平皿的菌落数都大于300，则计数Zui高稀释度的平皿，并记录为“>300 × 稀释倍数”或“多不可计”（TNTC）。

如果菌落蔓延覆盖了平皿的1/2以上，则不应计数。

第五步：结果计算与报告

计算公式：

异养菌总数 (CFU/mL) = 平均菌落数 × 稀释倍数

*例：某水样10⁻⁵稀释度的两个平皿菌落数为68和74，则平均数为71。结果 = 71 × 100,000 = 7,100,000 CFU/mL*

报告：结果通常以每毫升菌落形成单位（CFU/mL） 表示。一般保留两位有效数字，如 7.1 × 10⁶ CFU/mL。