体外细胞毒性MTT法试验 GB/T 16886/ISO 10993标准

MTT法：

1、将配制好的1×105/mL细胞悬液接种于96孔板，设空白对照、阴性对照、阳性对照和供试品组，每组各设至少6孔，每孔接种100uL细胞悬液，置CO2培养箱（含体积分数5%二氧化碳气体）37℃培养24h。

2、 培养24h后弃去原培养液，空白对照组加入新鲜细胞培养液，阴性对照组加入阴性对照品浸提液，阳性对照组加入阳性对照溶液或阳性对照品浸提液，供试品组分别加入100uL不同浓度的样品浸提液（、75%、50%、25%），置CO2培养箱继续培养24h。

3、 更换培养液24h后，置显微镜下观察细胞形态。每孔加入50uL质量浓度为1mg/mL的MTT溶液，继续培养2h后弃去孔内液体，加入100uL异丙醇，置振荡器上振荡，在酶标仪570nm和650nm波长下测定吸光度，计算相对增殖率（RGR）。

直接接触法：

1、 将已培养 48h～72h 生长旺盛的细胞用消化液消化后加入细胞培养液，用移液枪吹打混匀后在显微镜下计数，将细胞悬液配制成密度 1.0×105/mL，接种于直径 35mm 培养皿，每皿 2mL，共 9 皿。置 CO2培养箱 （5%CO2，37℃，＞90%湿度）培养至近汇合单层细胞形成。 

2、 弃去原培养液。加入 2mL 新鲜培养基，在培养皿中央部位的细胞层上轻轻放置一片供试样品，共 3 皿。 同法操作阴性对照、阳性对照各 3 皿。置 CO2培养箱（5%CO2，37℃，＞90%湿度）继续培养 24h。 

3、 培养结束后，于显微镜下观察细胞形态、空泡形成、脱落、细胞溶解和膜完整性等方面的变化，根据以下标准判断试验样品分级，分级大于 2 级时被认为有细胞毒性作用。

琼脂扩散法：

1、将已培养48h～72h生长旺盛的细胞用消化液消化后加入细胞培养液，用移液枪吹打混匀后在显微镜下计数，将细胞悬液配制成密度1.0×105/mL，接种于直径35mm培养皿，每皿2mL，共9皿。置CO2培养箱（5%CO2，37℃，＞90%湿度）培养至近汇合单层细胞形成。

2、弃去器皿中的培养基，将溶化琼脂与含血清的新鲜培养基混合,使琼脂Zui终质量浓度为0.5%～2%,并吸取适宜体积加入至每只培养皿内。细胞培养只能使用适合于哺乳动物细胞生长的琼脂。这种琼脂/培养基的混合物宜为液态,并且温度适合于哺乳动物细胞。加入2mL中性红液并在CO2培养箱孵育30min，孵育后丢弃多余的中性红液，将试验样品的平行试样小心地放在每只培养皿的固化琼脂层上,确保试样覆盖细胞层表面约十分之一，共3皿。同法操作阴性对照、阳性对照各3皿。置CO2培养箱（5%CO2，37℃，＞90%湿度）继续培养24h。 

3、培养结束后，将培养皿上的试样小心地从固化琼脂层取下，于显微镜下观察培养皿中细胞形态、空泡形成、脱落、细胞溶解和膜完整性等方面的变化，根据表1判断试验样品分级，分级大于2级时被认为有细胞毒性作用。